Genetické inženýrství otevírá lidstvu příležitosti k vytváření dříve neexistujících organismů a ničení genetických chorob. Věci však nejsou tak růžové, protože ani průlomová technologie CRISPR / Cas9 zdaleka není dokonalá. Chyby, které dělá, mohou být vzácné, ale jedna stačí k tomu, aby se člověku stala osudnou. Lenta.ru hovoří o tom, co je s CRISPR špatně a jak se vědci snaží situaci napravit.
Systém CRISPR / Cas9 - druh nůžek na DNA - je oprávněně považován za revoluci v oblasti genetického inženýrství. S jeho pomocí mohou vědci upravit lidský genom, odstranit z něj škodlivé mutace a léčit tak nepříjemná a smrtící dědičná onemocnění. Neměli bychom si však myslet, že takové metody dříve neexistovaly. V arzenálu genetiků byly například nukleázy obsahující zinkové „prsty“a endonukleázy - enzymy, které rozbíjejí molekuly DNA na konkrétních místech. Pokud jde o přesnost, univerzálnost a náklady, jsou znatelně nižší než CRISPR / Cas9, i když ten druhý není zdaleka dokonalý.
CRISPR / Cas9 původně nebyl vytvořen vědci, ale přírodou. Jedná se o molekulární mechanismus, který existuje uvnitř bakterií a umožňuje jim bojovat s bakteriofágy a jinými parazity. Ve skutečnosti funguje jako imunita proti infekci. CRISPR (zkratka pro „krátké palindromické repetice, pravidelně rozmístěné ve skupinách“) jsou speciální oblasti (loci) DNA. Obsahují krátké fragmenty DNA virů, které kdysi infikovaly předky dnešních bakterií, ale byly poraženi jejich vnitřní obranou. Tyto části se nazývají distanční vložky a jsou od sebe odděleny opakujícími se sekvencemi.
Když bakteriofág napadne bakterii, každá opakující se sekvence a sousední mezerník se použijí jako templát pro syntézu molekul zvaných crRNA. Vytváří se mnoho různých řetězců RNA, které se váží na protein Cas9, jehož úkol je extrémně jednoduchý: rozřezat DNA viru. Bude to však moci udělat až poté, co crRNA najde komplementární fragment virové DNA. Poté, co Cas9 rozdělí cizí nukleovou kyselinu, je nukleová kyselina úplně zničena jinými nukleázami.
CRISPR / Cas9 je vhodný právě pro svou přesnost, protože pro bakterie je správné fungování imunitního systému otázkou života a smrti. „Antivirový“systém musí najít část virové DNA mezi miliony dalších a co je nejdůležitější, nezaměňovat ji s vlastním genomem. Během milionů let evoluce tento mechanismus zdokonalily bakterie. Hned poté, co zjistili, proč je nutný systém CRISPR, si uvědomili, že jej lze zkrotit jako bezprecedentně přesný nástroj pro úpravu genů.
Chcete-li nahradit jednu specifickou oblast v genomu jinou, je nutné syntetizovat vodicí RNA, která je v principu podobná crRNA. Říká Cas9, kde je nutné provést dvouřetězcový zlom DNA modifikovaného organismu. Nepotřebujeme však gen pokazit, ale upravit ho - například nahradit jeden nebo více nukleotidů a odstranit škodlivou mutaci. Zde příroda opět přichází na pomoc. Přirozené opravné mechanismy okamžitě začnou obnovovat řezaný řetěz. Trik spočívá v tom, že za tímto účelem jsou některé fragmenty RNA odstraněny poblíž zlomu, načež jsou tam vloženy podobné sekvence. Vědci je mohou nahradit jejich vlastními sekvencemi DNA a modifikovat tak genom.
Schematické znázornění CRISPR
Propagační video:
Obrázek: Kaidor / Wikipedia
Nic však není dokonalého. Přes relativní přesnost CRISPR někdy dělá chyby. Jeden z důvodů spočívá v samotné povaze systému. Pro bakterie je nevýhodné, aby se crRNA stoprocentně kryla s fragmentem virové DNA, který se může lišit o jeden nebo dva nukleotidy. Je pro ni lepší, že se některé nukleotidy mohou lišit, což dává mikroorganismu větší šanci bojovat s infekcí. Zároveň v genetickém inženýrství hrozí nízká specificita s chybami: změny lze provádět na nesprávném místě. Pokud k tomu dojde v průběhu experimentů na myších, pak nebude žádná zvláštní tragédie, ale úprava lidského genomu by se mohla změnit v katastrofu.
To vysvětluje znepokojení západních vědců z experimentů prováděných v Číně. Asijští vědci použili technologii CRISPR ke genetické modifikaci lidských embryí. Takové experimenty byly v Evropě a ve Spojených státech zakázány, ale v poslední době je Spojené království povolilo - pouze pro výzkumné účely. Taková embrya budou muset být zničena za pár týdnů po obdržení, což vylučuje „chov“GM lidí.
CRISPR / Cas9 by však nebyl tak skvělý, kdyby se nedal vylepšit. Vědci tedy učili Cas9, aby neřezal dva řetězce najednou, ale pouze jeden. Řez je prováděn na dvou různých místech v sekvenci DNA na různých vláknech, takže systém musí být schopen rozpoznat dvakrát tolik nukleotidů než obvykle, což ho činí přesnějším.
Protein Cas a crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Vědci z University of Western Ontario našli další způsob, jak tuto technologii vylepšit. Pokusili se vyřešit problém opravy rozřezané DNA. Rychlé obnovení řetězce nukleových kyselin vede k tomu, že vědci nemají čas provádět vlastní opravy genomu. Vzniká tak začarovaný kruh: řetězec, který je nežádoucím způsobem opraven, musí být znovu přerušen proteinem Cas9.
Aby se tomu zabránilo, vědci upravili proteinové nůžky tak, aby vytvořili protein TevCas9. Řezá řetězec DNA na dvou místech, což ztěžuje opravu místa. K syntéze nového enzymu byl do Cas 9 přidán enzym I-Tevl, který je také endonukleázou, tj. Proteinem, který štěpí molekulu DNA uprostřed, místo aby štěpil konce sekvence, jak to dělají exonukleázy. Ukázalo se, že výsledný fúzní protein je přesnější ve vazbě na konkrétní místa a je méně pravděpodobné, že udělá chybu a ořízne nesprávné místo.
Krystalová struktura Cas9 vázaná na DNA
Foto: projekt wiki Cas9 / Wikipedia
Existuje další způsob, jak zlepšit přesnost systémů CRISPR. „Závody ve zbrojení“mezi bakteriemi a viry vedly nejen k vývoji obranných systémů v mikroorganismech, ale také ke způsobům jejich neutralizace. Bakteriofágy tedy rychle mutují a ztrácejí oblasti, podle nichž je bakteriální imunita rozpoznává. Některé kódy pro anti-CRISPR proteiny však interferují s prací komplexu crRNA-Cas9.
8. prosince zveřejnil časopis Cell článek vědců z Toronské univerzity, kteří vytvořili „anti-CRISPR“- systém, který za určitých podmínek umožňuje tento mechanismus vypnout. Zabraňuje nežádoucím chybám potlačením aktivity Cas9 v případě, že se naváděcí RNA váže na nesprávný fragment. Anti-CRISPR se skládá ze tří proteinů, které inhibují nukleázu a jsou kódovány geny jednoho z bakteriálních virů.
Technologie CRISPR se již používá k léčbě závažných onemocnění, jako je leukémie a rakovina plic, a také se testuje na odstranění HIV z imunitních buněk. Jak vědci najdou nové způsoby, jak tuto metodu vylepšit, otevře se stále více příležitostí pro její aplikaci.
Alexander Enikeev