Vzorky tkáně mumií pod názvy „Maria“a „Vavita“byly poslány z Peru do ruské laboratoře k výzkumu. Poskytnuté vzorky biologických tkání byly studovány pomocí rastrovací elektronové mikroskopie, Ramanova spektra, ICPE a bylo zkoumáno složení křemeliny (látka na povrchu kůže mumií). Rovněž byla provedena studie DNA přenesených tkání.
příprava vzorků
Vzorky tkání o 500 μg byly přeneseny do plastových zkumavek a rozpuštěny v 1 ml pufru (10 mM Tris-HCI pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). K výsledným suspenzím byl přidán Na dodecylsulfát na 0,5%, zahříván na +80 ° C a po 10 minutách byla proteináza K (až do 500 ug / ml) umístěna na 24 hodin do termostatu (+55 ° C).
Deproteinizace byla prováděna fenolickou metodou: přidání fenolu ve stejném objemu k suspenzi, poté fenol: chloroform (1: 1), chloroform; po každém přidání bylo provedeno konstantní míchání na úhlovém rotoru a centrifugace při 15 000 ot / min, 10 min.
K super-sedimentu získanému po třetí centrifugaci bylo přidáno 1/10 části objemu 1 M NaCl a 2,5 objemu dvakrát destilovaného ethylalkoholu a ponecháno přes noc při -30 ° C v kónických zkumavkách - "Eppendorf". Centrifugace byla prováděna při 15 tis. min. během 10 minut a obdržel DNA „vysrážený“ve formě hnědé sraženiny. Peleta DNA byla dvakrát promyta 70% ethylalkoholem a sušena při teplotě místnosti (1 h) a poté rozpuštěna v TE pufru.
PCR byla prováděna na programovatelném tepelném cyklovači "My Cycler" ("Bio = Rad") za použití standardních oligoprimerů syntetizovaných metodou na pevné fázi ve sdružení "Beagler" (St. Petersburg). Reakční směs pro amplifikaci s objemem 25 μl zahrnovala: 15 nM každého oligoprimeru, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 při +25 ° C, 16,6 mM (NH4) S04, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoethanolu, 170 μg / ml BSA a směs čtyř základních dNTP v koncentraci 1,0 mM každý a termostabilní DNA polymeráza Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Po denaturaci (10 minut, 94 ° C) bylo provedeno 35 amplifikačních cyklů pro každý testovací systém: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Pro kontrolu specificity byly do reakce zavedeny vzorky DNA se známými genotypy pro studované lokusy (markerové systémy) a kontrolní vzorky.obsahující směs reagencií bez DNA. Po amplifikaci byl k alikvotům reakční směsi (7 μl) přidán barvicí pufr a separován vertikální elektroforézou v 6% polyakrylamidovém gelu (210x150x1 mm), obarven ethidiumbromidem a fotografován pod ultrafialovým světlem. K identifikaci alel byly použity alelické standardy odpovídající těmto lokusům („žebříky“).
Propagační video:
DNA analýza
Pro studii jsme použili metodu exome analýzy lidské DNA založené na vysokovýkonném sekvenování s obohacením hybridizací.
Technika exome analýzy lidské DNA.
Byly analyzovány 2 vzorky … Všechny fáze přípravy vzorků před PCR byly provedeny v čistých místnostech. Příprava vzorků, extrakce DNA a amplifikace jednotlivých fragmentů DNA byly prováděny v různých místnostech.
Specifické adaptéry (KAPA Library Prepar Kit Kit a SeqCap Adapter Kit; Roche) byly ligovány na konce genomické fragmentované DNA (~ 5 ng), poté byl proveden dvoustupňový výběr fragmentů v rozsahu délky 200-350 bp pomocí perliček AMPureXP (Beckman Coulter). … Výsledné fragmenty byly amplifikovány s použitím primerů specifických pro adaptér a hybridizovány s biotinylovanými specifickými sondami (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) po dobu 28 hodin při 47 ° C. V jedné reakci byly spojeny dva vzorky DNA. Biotinylované hybridy sonda-DNA byly izolovány a purifikovány pomocí magnetických částic konjugovaných se streptovidinem, bylo provedeno druhé amplifikace a kvalitativní hodnocení výsledné knihovny DNA (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Aby se odstranily fragmenty amplifikace mimo cíl a dimery adaptéru, DNA knihovna byla znovu přečištěna pomocí magnetických částic AMPureXP Beads (obr. 1). Konečná koncentrace připravené knihovny byla vyhodnocena na přístroji Quantus s použitím komerční sady QuantiFluor® dsDNA System (Promega). Výsledná DNA knihovna byla imobilizována na povrch průtokové buňky. Sekvenování bylo provedeno na platformě Illumina pomocí standardního průtokového článku a soupravy MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 cyklů). Výsledná DNA knihovna byla imobilizována na povrch průtokové buňky. Sekvenování bylo provedeno na platformě Illumina pomocí standardního průtokového článku a soupravy MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 cyklů). Výsledná DNA knihovna byla imobilizována na povrch průtokové buňky. Sekvenování bylo provedeno na platformě Illumina pomocí standardního průtokového článku a soupravy MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 cyklů).
Postava: 1
Obecné hodnocení kvality sekvenované DNA
Pro počáteční hodnocení kvality byly použity standardní metody, jako jsou FastQC a programy Medúzy a KraTER. Posouzení kvality neprokázalo žádné problémy s kvalitou sekvenovaných odečtů DNA pro oba vzorky. Obrázky nejsou zobrazeny, protože nejsou informativní.
Pro první vzorek (další M, velká mumie "Maria") bylo sekvenováno 113,4 M čtení, pro druhý vzorek (další W, malá mumie "WaWita") 22,9 M čtení bylo sekvenováno.
Dalším krokem bylo očištění sekvenovaných čtení z různých technických sekvencí, které by narušovaly další analýzu. K tomu byl použit program Cookiecutter. Po vyčištění byly zjištěny hodnoty 113,3 M (99%) a 22,8 M (99%) pro M a W.
Odhad množství staré DNA a její separace od moderního
Standardní metoda pro hodnocení přítomnosti a množství staré DNA je odhadnout množství časově poškozených nukleotidů. K tomu byl použit program MapDamage 2.0. MapDamage 2.0, která ukazovala množství staré DNA v 30,1%, ale protože MapDamage naznačuje, že používáme úzký odkaz a nevíme přesně, jak blízko jsou oba vzorky genomu moderních lidí, a použili jsme exome knihovnu, tato metoda sama o sobě nebyla dostatečný. Další dobrou metodou pro hodnocení staré DNA je počet krátkých fragmentů.
Filtrace údajné starověké DNA proběhla ve třech fázích. V první fázi jsme odstranili všechna spárovaná čtení, která nelze překročit a sestavili do jednoho nepárového čtení s překrytím. Tyto hodnoty ukazují, že původní fragment, který byl sekvenován, byl delší než 300 bp. a nejspíše moderní DNA. Po tomto kroku tedy zůstalo 86,9% a 91,8%. Poté byly jednotlivé překrývající se fragmenty vybrány tak, aby jejich délka byla kratší než 150 bp, protože to je délka, kterou jsme očekávali u staré DNA. Po tomto kroku zůstalo 8,6%, respektive 38,5%, u vzorků M a W. Je třeba poznamenat, že i přes rozdíl v procentech je absolutní počet odečtů mezi vzorky M a W velmi podobný: 9,8 M a 8,8 M, což lze vysvětlit skutečností, že obsah staré DNA v obou vzorcích je podobný.
| Parametr | Ukázka M (Maria) | Ukázka W (Wawita) |
| Počet čtení | 113,3M | 22,8M |
| Procento krátkých fragmentů <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Procento krátkých fragmentů <150 bp (počet) |
8,6% (9 846 035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Procento fragmentů seřazených podle lidského genomu (počet) |
2,03% (2 345 084) |
9,65% (2 264 551) |
| Procento fragmentů seřazených na lidský genom od krátké <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Získání DNA podobné referenčnímu lidskému genomu
Výsledná domnělá starověká DNA byla mapována na referenční lidský genom pomocí standardního vyhledávacího potrubí genomové varianty používajícího BWA, samtooly a Wcftools.
Navíc pouze 23,8% vzorku M a 25,6% bylo úspěšně mapováno na referenční genom moderních lidí. Současně, pro oba vzorky, 75% sekvenovaných čtení nemohlo být mapováno na lidský genom. To lze vysvětlit kontaminací a skutečností, že tyto vzorky jsou umístěny dostatečně daleko od genomu moderních lidí. Současně je třeba mít na paměti, že jsme sekvencovali exomovou knihovnu a minimalizovali tak kontaminaci bakteriální DNA.
Počáteční průzkumná analýza nevařených odečtů ukázala, že některé z nich patřily k opakujícím se DNA specifickým pro kopytníky, což lze vysvětlit skutečností, že při mumifikaci byl použit lama tuk.
Podrobnější analýza vyžaduje asi tři týdny výpočtů, protože stávající řešení jsou vytvářena pouze pro virové a bakteriální genomy, a my musíme porovnat se všemi existujícími genomy, včetně rostlinných genomů, abychom pochopili, které druhy byly sekvenovány.
Charakteristika nalezených možností
Mapované čtení bylo použito k hledání variant, které odlišují vzorky M a W od moderního lidského genomu, a také k posouzení kontaminace čtení z lidského Y chromozomu.
První otázkou, na kterou bylo třeba odpovědět, bylo mapování chromozomů, na které byly sekvenované čtení.
Protože víme, že Mariainy vzorky byly izolovány z kostí a svalů a Vavita pouze z kostí, očekávali jsme rozdíl v množství mtDNA. Ale nebyl tam žádný velký rozdíl.
Počet mapovaných odečtů na Y je dalším testem kontaminace moderními lidmi. Je zajímavé, že v obou vzorcích se ukázalo, že je to stejné.
Statistiky nalezených variant jsou uvedeny níže:
| Parametry | Ukázka M (Maria) | Ukázka W (Wawita) |
| Počet nalezených možností | 79957 | 48941 |
| Počet možností na Y | 534 | 541 |
| Počet spolehlivých možností (více než 20 čtení a více než 30 kvalit) | 16969 | 6181 |
| Varianty se známým rsid (k dispozici v databázi výstřižek) | 5701 | 3089 |
| Obecné platné možnosti | 92 | |
| běžné možnosti s rsid | 49 |
Poté bylo možné odpovědět na otázku: jsou M a W příbuzní? Odpověď je ne.
Bylo nalezeno pouze 49 shodných variant mezi M a W a 3040, které se lišily u variant se známou rsid. Navíc to jsou možná různé typy nebo poddruhy osoby nebo neznámého tvora.
Je zajímavé, že varianty s chromozomem Y jsou identické pro oba vzorky, což ukazuje na kontaminaci stejnou osobou, a že ve staré DNA chromozomu Y pravděpodobně není žádný chromozom.
Vyhodnocení podobnosti s existujícími sekvenovanými lidskými genomy z projektu 1000 Human Genome Project
Všimněte si, že se jedná pouze o přibližnou analýzu, protože pro přesnější analýzu jsou nutné varianty z oblastí genomu pod neutrálním výběrem a máme exome data.
Nicméně s použitím 5708 variant pro M nebo 3096 pro S bylo možné provést variantu analýzy ve srovnání s daty 1000 lidských genomů.
Výsledkem analýzy PCA na obrázku níže je překrytí dvou obrázků pro M a W, počítáno samostatně, protože mezi M a W je příliš málo společných možností pro odhad vzdálenosti mezi M a W.
Skóre podobnosti.
Jak vidíte, neexistuje žádná shoda s žádnou skupinou genů, liší se také od sebe navzájem. Je však třeba mít na paměti, že jsme použili kódující sekvence pod selekcí a doporučuje se používat varianty pod neutrálním výběrem.
Výsledek PCA je nicméně v dobré shodě s ručním ověřením variant, které ukázaly, že data jsou v nereferencovaném homozygoti, což opět naznačuje, že obrázky jsou daleko od moderního lidského genomu.
Závěr
Bohužel jsme byli omezeni pouze na dva vzorky, obvykle se v tomto typu analýzy používá více, alespoň 3 až 10 alespoň nějak souvisí. Proto je nutné pokračovat ve výzkumu s velkým počtem vzorků.
Zároveň můžeme s největší pravděpodobností dojít k závěru, že vzorky DNA Marie a Vavity odpovídají lidské DNA, ale neshodují se s DNA, kterou máme k dispozici z databáze 1000 lidí.
Autoři zprávy: Baranov V. S. a Aseev M. V. (Vědecko-výzkumný ústav porodnictví a gynekologie, oddělení prenatální diagnostiky), Glotov A. S. a Glotov O. S. (St. Petersburg State University), A. S. Komissarov (Cytologický ústav, Ruská akademie věd, Centrum pro genetickou bioinformatiku).
Materiály poskytnuté Konstantinem Georgievichem Korotkovem (doktor technických věd, profesorem, Univerzitou informačních technologií, mechaniky a optiky) a Dmitrijem Vladislavovičem Galetským (kandidát lékařských věd, Pavlovská první lékařská univerzita v Petrohradě).
Další informace o mumiích Nazca najdete ve značce: mumie Nazca.