Vědci vkládají velké naděje do technologie CRISPR / Cas9, která umožňuje vysoce přesné změny v genomech živých organismů, včetně lidí. Jsou publikovány všechny nové vědecké články popisující různé typy systémů CRISPR a jejich modifikace. „Lenta.ru“hovoří o objevech v této oblasti, k nimž došlo v roce 2016.
Tisíce z nich
CRISPR / Cas9 je bakteriální adaptivní imunitní systém, který umožňuje mikroorganismům bojovat proti virům. Skládá se z spacerů - úseků DNA odpovídajících určitým fragmentům (protospacerům) DNA infekčního agens. Distanční vložky kódují specifické molekuly crRNA, které se vážou na enzym Cas9. Výsledný komplex se váže na řetězec DNA viru a Cas9 funguje jako nůžky a stříhá jej.
CRISPR / Cas9 je ve skutečnosti jen jedním z mnoha podobných systémů, které bakterie a archaea mají. Vědci je rozdělují do dvou tříd. První třída zahrnuje systémy CRISPR typu I, III a IV a druhá - II a V. Typ II obsahuje protein Cas9 zapojený do získávání nových spacerů, akumulace crRNA v buňce a štěpení DNA. V jiných systémech se pro tyto účely používají multiproteinové komplexy. Díky tomu je typ II nejjednodušším typem systému CRISPR vhodným pro potřeby genetického inženýrství.
Typy lze zase rozdělit na podtypy podle toho, které další geny jsou spojeny s CRISPR. Například systémy IIA obsahují gen csn2, který kóduje protein, který se váže na DNA a podílí se na získávání spacerů. V systémech IIB chybí csn2, ale existuje gen cas4, jehož funkce je stále neznámá, a systémy IIC nemají ani csn2, ani cas4.
Poklady uvnitř bakterií
Propagační video:
Všechny známé systémy CRISPR byly objeveny vědci v bakteriích pěstovaných v laboratorních podmínkách. Existuje však obrovské množství nekultivovaných mikroorganismů, které zahrnují jak archaea, tak bakterie. Obvykle žijí v extrémních podmínkách - minerální prameny nebo toxické vodní útvary v opuštěných dolech. Vědci však od nich mohou izolovat DNA a identifikovat v nich konkrétní oblasti. V novém článku publikovaném v Nature 22. prosince genetici z Kalifornské univerzity v Berkeley dekódovali genomy z přírodních mikrobiálních komunit a objevili další variace systému CRISPR.
Bakteriofág - virus, který infikuje bakterie
Obrázek: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Vědcům se podařilo zjistit, že některé typy málo studovaných archeopodobných nanoorganismů ARMAN také mají CRISPR / Cas9, ačkoli se dříve věřilo, že je mají pouze bakterie. Je třeba poznamenat, že tento systém zaujímá mezilehlé místo mezi podtypy IIC a IIB a může sloužit jako obrana proti parazitickým „skokovým“genům (transpozonům) vstupujícím do mikroorganismu z jiných archaeí. Pokus reprodukovat aktivitu archaeálního CRISPR / Cas9 v E. coli (Escherichia coli) k ničemu nevedl, což naznačuje existenci některých dalších specifických mechanismů regulujících systém.
Nové typy systémů druhé třídy, CRISPR / CasX a CRISPR / CasY, byly také izolovány z bakterií žijících v podzemních vodách a sedimentech. Systém CRISPR / CasX zahrnuje proteiny Cas1, Cas2, Cas4 a CasX. Posledně jmenovaný, jak ukazují experimenty na E. coli, se vyznačuje aktivitou nukleáz, to znamená, že je schopen štěpit cizí DNA, jako je Cas9. K tomu však dochází, pouze pokud je sekvence TTCN před protospacery, kde N je kterýkoli ze čtyř nukleotidů. Takové sekvence se nazývají PAM (motiv sousedící s protospacerem - motiv sousedící s protospacerem). Systém CRISPR / Cas9 má také vlastní PAM - NGG, který by měl být umístěn za protospacerem. Kromě toho je CRISPR / CasY schopen štěpit DNA, pokud je poblíž cílového místa sekvence TA PAM.
Jaký je příslib tohoto objevu? Faktem je, že detekované systémy jsou v současnosti nejkompaktnějšími systémy. Podle vědců je díky malému množství proteinů potřebných pro jejich práci CRISPR / CasX a CRISPR / CasY vhodným nástrojem pro editaci DNA. Kromě toho metagenomické studie, ve kterých se studuje DNA získaná z prostředí, odhalí další typy systémů CRISPR, které jsou užitečné pro genetické inženýrství.
Cesta k dokonalosti
Samozřejmě existuje alternativa k hledání systémů CRISPR v přírodě - vylepšení již existující technologie CRISPR / Cas9. I přes svou vysokou přesnost dělá chyby řezáním DNA na špatném místě. To ztěžuje provedení správných změn v genech, a proto účinně léčí dědičné choroby. Vědci proto hledají způsoby, jak zlepšit výkon systému. V roce 2016 vyšlo mnoho vědeckých prací věnovaných úpravám CRISPR a jejich přeměně na různé genové nástroje.
Protein Cas9 a crRNA - hlavní součásti systému CRISPR
Obrázek: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
8. prosince tedy časopis Cell publikoval článek vědců z University of Toronto, kteří vytvořili „anti-CRISPR“- systém, který za určitých podmínek mechanismus vypíná. To vám umožní potlačit aktivitu Cas9, pokud se naváděcí RNA váže na nesprávný fragment a předchází chybám. Anti-CRISPR se skládá ze tří proteinů inhibujících nukleázu. Přirozeně to původně nevynalezli vědci, ale viry, které tak neutralizovaly imunitu bakterií.
V červnu američtí vědci spolu s ruskými kolegy potvrdili, že systém CRISPR / C2c2 získaný z fusobacterium Leptotrichia shahii je schopen štěpit jednovláknovou RNA. Výsledkem je, že systém CRISPR lze použít k vyřazení - potlačení funkcí - messengerové RNA, která přenáší informace z genů do ribozomů, kde jsou na jeho základě syntetizovány proteiny.
V květnu vytvořili vědci z Kalifornské univerzity CRISPR-EZ, technologii, která umožňuje vkládání nových molekul DNA do genomů myších embryí s téměř 100% úspěchem. Systém CRISPR / Cas9 se vstřikuje do oplodněných zvířecích vajec pomocí mikroskopické jehly a malého elektrického výboje. Ve svém experimentu se vědcům podařilo zavést mutaci v genu u 88 procent myší. To přesahuje počet geneticky modifikovaných myší produkovaných úpravou CRISPR, která používá konvenční injekce.
V dubnu vyvinuli molekulární biologové na Lékařské fakultě University of Massachusetts pomocí mutantní varianty Cas9, která postrádá aktivitu nukleáz, technologii CRISPRainbow. Vodicí RNA, která označuje, kde se enzymy váží, obsahovala fluorescenční značky, což umožňuje například sledovat pohyb mobilních genetických prvků.
Komár Anopheles může být první obětí systémů CRISPR
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Statečný nový svět
Vědci již používají systémy CRISPR k vytváření geneticky modifikovaných organismů, jako je například malárie komár, které šíří škodlivé geny mezi svými divokými příbuznými. Tato metoda se nazývá genová jízda. Pokud byl jeden z rodičů jedince nositelem mutantního genu, předá jej svému potomkovi s 50% pravděpodobností. Je to proto, že rodič má dvě kopie genu a pouze jedna z nich je vadná. CRISPR je schopen kopírovat mutantní fragment a vložit jej do zdravého genu. Výsledkem je, že potomci získají mutaci se 100% pravděpodobností.
V roce 2016 schválili odborníci z Poradního výboru pro rekombinantní DNA (RAC) žádost University of Pennsylvania o provedení testů lidské genetické modifikace pomocí technologie CRISPR / Cas9.
Číňané je však předstihli. V listopadu časopis Nature uvedl, že čínští vědci poprvé zavedli do buněk buňky s geny modifikovanými systémem CRISPR / Cas9. Vědci extrahovali imunitní buňky (T-lymfocyty) z krve pacienta s metastatickým karcinomem plic a poté pomocí technologie CRISPR vypnuli gen kódující protein PD-1. Ukázalo se, že tato látka potlačuje imunitu podporou růstu nádoru. Vědci kultivovali upravené buňky, zvýšili jejich počet a poté je injektovali zpět do lidského těla. Zda genová terapie zvládne toto onemocnění, se teprve uvidí.
Systémy CRISPR lze také použít k boji proti HIV a dědičným chorobám lidí. K vývoji účinné léčby je však nutný další výzkum. Samozřejmě nemluvíme o mutantech, jako ve sci-fi filmech, ale vědci budou schopni rychle vytvářet geneticky modifikované organismy, například zemědělské rostliny odolné vůči parazitům. Uvidíme, proč vědci, kteří objevili CRISPR a zjistili, jak by se mohl použít, ještě nezískali Nobelovu cenu.
Alexander Enikeev