Mezinárodní tým vědců ze Spojených států, Francie a Číny vytvořil polosyntetickou formu života. Ačkoli již byly učiněny pokusy o získání bakterií s modifikovanou DNA, mikroorganismy se špatně množily, vyžadovaly zvláštní podmínky růstu a nakonec se zbavily modifikací zavedených do nich. „Lenta.ru“hovoří o novém díle, ve kterém se vědcům podařilo tyto problémy vyřešit, protože získali tvora, který se radikálně liší od veškerého přirozeného života na Zemi.
V poslední době se DNA všech živých organismů na naší planetě skládala ze čtyř typů nukleotidů obsahujících adenin (A) nebo thymin (T) nebo guanin (G) nebo cytosin ©. Řetězce desítek nebo stovek milionů nukleotidů tvoří oddělené chromozomy. Geny nalezené na chromozomech jsou v podstatě dlouhé nukleotidové sekvence, ve kterých jsou kódovány aminokyselinové sekvence proteinů. Kombinace tří po sobě následujících nukleotidů (kodon nebo triplet) odpovídá jedné z 20 aminokyselin. Život tedy používá třípísmenný genetický kód (ATG, CGC atd.) Založený na čtyřpísmenné abecedě (A, C, T, G).
Když buňka organismu potřebuje protein (polypeptid), zapne se gen, který ji kóduje. Ten je připojen ke speciálnímu enzymu nazývanému RNA polymeráza, který během procesu transkripce začíná sledovat sekvenci nukleotidů a vytvářet jeho kopii ve formě molekuly zvané messenger RNA (mRNA). RNA je velmi podobná DNA, ale místo tyminu obsahuje uracil (U). Poté mRNA opouští buněčné jádro a jde do ribozomů, kde slouží jako recept na vytvoření aminokyselinového řetězce proteinu během translace.
Vědci se rozhodli změnit genetický kód Escherichia coli přidáním dalších dvou „písmen“. Faktem je, že DNA v živých organismech je dvojitá, to znamená, že je tvořena dvěma řetězci, které jsou navzájem spárovány komplementárními vazbami. Takové vazby se tvoří mezi bází A-nukleotidu z jednoho řetězce a bází T-nukleotidu z druhého (podobně mezi C a G). Proto musí být dva nové syntetické nukleotidy také schopné komplementárního párování. Volba padla na dNaM a d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH
Jeden pár syntetických nukleotidů byl vložen do plazmidu - dvouvláknové kruhové molekuly DNA schopné množit se odděleně od zbytku bakteriálního genomu. Nahradili dvojici komplementárních nukleotidů A a T, které byly součástí laktózového operonu - soubor genů, které metabolizují laktózový cukr, a nekódující DNA sekvence s nimi spojené. Syntetické nukleotidy nebyly zahrnuty do oblasti, kterou polymeráza kopíruje v mRNA.
Propagační video:
Proč se vědci rozhodli nevložit syntetické nukleotidy přímo do genu, ale vedle něj? Faktem je, že je velmi obtížné takto změnit gen, aby zůstal funkční. Koneckonců, k tomu musíte vázat výsledné nové kodony na jakoukoli aminokyselinu. K tomu je zase nutné naučit buňku produkovat různé typy transportní RNA (tRNA), které tyto kodony rozpoznají.
Molekuly tRNA plní následující funkci. Stejně jako nákladní automobily nesou na jednom konci určitou aminokyselinu, přibližují se k mRNA v ribozomech a zase začínají spojovat triplet nukleotidů na druhém konci s kodonem. Pokud se shodují, aminokyselina se odstraní a zabuduje do proteinu. Pokud však neexistuje vhodná tRNA, protein nebude syntetizován, což může negativně ovlivnit životaschopnost buněk. Proto by zavedením syntetických nukleotidů do genů museli vědci vytvořit geny kódující nové tRNA, které dokážou rozpoznat umělé kodony a připojit správnou aminokyselinu k polypeptidu. Úkol vědců však byl jednodušší. Potřebovali zajistit, aby se plazmid se syntetickými nukleotidy úspěšně množil a přenesl na dceřinné organismy.
Plazmidy používané k transformaci Escherichia coli
Obrázek: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Příroda / Katedra chemie / Výzkumný ústav Scripps
Tento plazmid, označený jako pINF, byl zaveden do E. coli. Pro jeho kopírování je však nutné, aby bylo uvnitř bakteriální buňky přítomno mnoho nukleotidů. Za tímto účelem byl do E. coli vložen další plazmid, pCDF-1b. Obsahoval gen pro rozsivku Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, který kóduje protein NTT, který transportuje nukleotidy z živného média do buňky.
Vědci však čelili řadě problémů. Za prvé, proteiny Phaeodactylum tricornutum mají toxický účinek na buňku E. coli. Všechno kvůli přítomnosti fragmentu aminokyselinové sekvence, který nese signalizační funkci, v nich. Díky ní protein zaujímá správnou pozici v buňce řas, po které je sekvence odstraněna. E. coli není schopen tento fragment odstranit, takže jí vědci pomohli. Podařilo se jim odstranit prvních 65 aminokyselin z NTT. To významně snížilo toxicitu, i když také snížilo rychlost transportu nukleotidů.
Dalším problémem bylo, že syntetické nukleotidy zůstaly v plazmidu po dlouhou dobu a nebyly nahrazeny při kopírování DNA. Jak se ukázalo, jejich bezpečnost závisela na tom, jaké nukleotidy je obklopují. Vědci analyzovali různé kombinace vložené do 16 plazmidů. Abychom pochopili, zda syntetický nukleotid ze sekvence vypadl, použili vědci technologii CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9
Obrázek: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 je molekulární mechanismus, který existuje uvnitř bakterií a umožňuje jim bojovat proti bakteriofágům. Jinými slovy, tato technologie představuje imunitu proti virovým infekcím. CRISPR je speciální kousek DNA. Obsahují krátké fragmenty DNA virů, které kdysi infikovaly předky dnešních bakterií, ale byly poraženi jejich vnitřní obranou.
Když bakteriofág vstoupí do bakterií, tyto fragmenty se používají jako templát pro syntézu molekul zvaných crRNA. Vytváří se mnoho různých řetězců RNA, které se váží na protein Cas9, jehož úkolem je snížit DNA viru. Může to udělat až poté, co crRNA najde komplementární fragment virové DNA.
Pokud se místo crRNA použije sekvence RNA komplementární k určitému fragmentu plazmidu, potom Cas9 plazmid také rozštěpí. Ale pokud jsou v tomto fragmentu syntetické nukleotidy, pak protein nebude fungovat. Použitím CRISPR je tedy možné izolovat ty plasmidy, které jsou rezistentní na nežádoucí mutace. Ukázalo se, že u 13 ze 16 plazmidů byla ztráta syntetických nukleotidů zanedbatelná.
Vědcům se tedy podařilo vytvořit organismus se zásadními změnami v DNA, který je schopen je v sobě uchovat na neurčito.
Ačkoli polosyntetická forma života má ve svém genomu pouze dva nepřirozené nukleotidy, které se nenacházejí v kodonech a nepodílejí se na kódování aminokyselin, jedná se o první rezistentní organismus, jehož abeceda DNA se skládá ze šesti písmen. V budoucnu budou vědci s největší pravděpodobností schopni použít tuto inovaci k syntéze proteinů, čímž vytvoří plnohodnotný umělý genetický kód.
Alexander Enikeev