Vynález editoru genů CRISPR-Cas se nazývá revoluce v biologii. Vědci slibují, že budou použity ke zlepšení odrůd rostlin a plemen zvířat pro zemědělství, k léčbě vrozených genetických chorob u lidí. Korešpondent RIA Novosti se podíval, kdo a jak je genom upravován.
Centrum pro editaci genomu Moskevské státní univerzity bylo otevřeno před více než rokem - na akademické půdě. Setkal jsem se s jeho ředitelem, doktorem chemie Peterem Sergievem, a zatímco jedeme ve výtahu, věnuje se trochu historii genetického inženýrství.
„Genom byl již upraven. Vytvoření nástrojů k tomu však bylo obtížné, trvalo to dlouho a výsledek často nebyl tak, jak jsme to chtěli, “říká.
Ve viváriu se Pyotr Vladimirovich mění v modré laboratorní oděvy, dávají mi jednorázové bílé kombinézy a žádají mě, abych otřel fotoaparát alkoholem. Nyní Petr Vladimirovič vypadá jako chirurg a já - jako laboratorní asistent ze série „CSI - Crime Scene“.
Ve sterilní laboratoři pro nás byla připravena nádoba s oplodněnými myšími vajíčky a zkumavka s roztokem RNA. To je vše, co potřebujete pro úpravy genomu CRISPR-Cas.
CRISPR je anglická zkratka pro frázi, která doslova znamená „pravidelně seskupené krátké palindromické opakování“. Ve skutečnosti jsou to jen malé části DNA bakteriofágových virů zabudovaných do bakteriálního genomu. Tyto sekvence jsou nezbytné, aby bakteriální imunitní systém fungoval a sloužil jako jakési oznámení „policie hledané“. Pokud bakterie přežije poté, co byla infikována bakteriofágem, použije proteinové enzymy Cas k odříznutí části DNA a vložení do svého genomu, aby byla později rozpoznána. Bakteriální genom zdědí tuto knihovnu „nepřátel“pečlivě shromážděnou předchozími generacemi.
V roce 2013 vědci zjistili, že protein Cas působí v jakémkoli organismu, včetně savců. Je schopen provést směrové zlomy v obou řetězcích molekuly DNA, a tak změnit genom.
Propagační video:
Manipulace s vejci
Petr Sergiev vyrábí skleněnou kapiláru o průměru sto mikronů v mikropodniku, vtáhne do něj vajíčko a přenese ho pod sklem živným médiem. Hotový vzorek se odešle do fáze optického mikroskopu. Monitor zobrazuje zvětšený obrázek vajíčka a chvěje se na špičce kapiláry. Vyčnívají dvě zaoblená místa - jedná se o pronuclei s DNA matky a otce.
Vědec připravuje další kapiláru o řádově menším průměru. Toto je injekční stříkačka. Sbírá do něj roztok se dvěma typy RNA a pomocí manipulátorů vajíčko jemně propíchne. To je vše, injekce je hotová.
RNA vstřikovaná do vajíčka je potřebná pro snížení genomu v daném místě. Jeden typ RNA obsahuje přesně definovanou sekvenci nukleotidů, podobnou té, kterou jsme chtěli změnit. Úkolem této RNA je najít odpovídající oblast v DNA, proto se nazývá „průvodce“. RNA druhého typu, matrice, je druh instrukce pro syntézu nukleasového proteinu Cas9. Tento protein působí jako katalyzátor pro chemickou reakci, která narušuje fosfodiesterové vazby mezi dobře definovanými bázemi DNA. Protože molekula proteinu má dvě nukleázová centra, jsou obě vlákna DNA otevřena, navíc na místě, jejichž souřadnice Cas9 "spočítaly" s vodící RNA.
Molekula DNA vnímá zlom v obou řetězcích jako závažné zhroucení a snaží se jej opravit. Exonukleázové enzymy plovoucí v buňce okamžitě odstraní několik nukleotidů z obou konců zlomku. To je dost na to, aby se zlomil, nebo, jak říkají genetici, „vypněte“gen.
Jak funguje genomický editor CRISPR-Cas9 / Ilustrace od RIA Novosti. Alina Polyanina.
Je-li například požadována řízená mutace, je nutné označit protein, aby byl sledován v těle, pak se ke komplexu přidá dvě templáty ke dvěma RNA ve formě speciálně navržené DNA. Skládá se ze sekvencí identických s hranami budoucího zlomu a obsahuje také část, která se má vložit. Poté, co Cas9 odřízl DNA molekulu, jsou její konce spojeny pomocí této další šablony, takže sada nukleotidů, kterou potřebujeme, je vložena do konce.
"K veverce můžeme připojit malý ocas, pomocí kterého je vhodné ji vytáhnout a zjistit, s čím interaguje." Můžeme vložit gen, ale není tak účinný jako jeho vypnutí, “vysvětluje vědec.
GMO a chiméry
Upravené vajíčko bude transplantováno do děložní zkumavky náhradní myši. Nějakou dobu žila s mužem, jehož semenné trubičky byly svázány. Pár měl normální sexuální život, ale nedokázal si představit. Tělo myši přesto věřilo, že je těhotná, a vytvořilo pro ni vhodné hormonální pozadí. Nyní tato žena nese plod někoho jiného.
Za tři týdny porodí nejběžnější myši. Vědci budou čekat, až hlodavci dorostou, odeberou z nich malý kousek ocasu a pomocí PCR analyzují část DNA, kterou upravili. Ve více než polovině případů se nachází mutace nebo deaktivovaný gen. Reverzní postup - vložení sekvence do genomu - uspěje v ne více než 10% experimentů.
Při úpravách se objevují různé zajímavé efekty. Například se rodí mozaikové myši nebo chiméry, které mají buňky s různými variacemi mateřských a otcovských genomů. Cas9 může řezat DNA mnohokrát, ale messenger RNA, která jej kóduje, není věčná a injikované řešení jednoduše zmizí v řadě buněčných dělení. Někdy editor stále střílí i poté, co se pronuclei spojily a vejce se sdílelo. A protože oprava DNA po prasknutí je vždy náhodný proces a léčení se nikdy nestane stejným způsobem, budou některé buňky v jednom organismu obsahovat další mutaci.
Pro vědu a medicínu
Přesuneme se do sousední místnosti a sledujeme živé výsledky experimentů na úpravu genomu. Na polích nalevo - nádoby s geneticky modifikovanými myšmi, vpravo - s běžnými hlodavci pro kontrolu. Byli pěstováni, stejně jako ti vlevo, ale genom nebyl zmanipulován. Kontrolní myši jsou potřeba, aby měly před našimi očima normu a porovnaly s nimi získané bytosti.
Pyotr Sergiev vezme jeden z kontejnerů párem šedých myší. Navenek jsou zcela obyčejní, ale nemají potomka. Faktem je, že u samců je vypnut gen jedné z RNA methyltransferáz, enzymu produkovaného pouze ve spermiích. Samci s inaktivním genem se rodí sterilní. Přesný účel genu a enzymu je stále neznámý. Abychom to zjistili, byly v laboratoři chovány dva kmeny myší: jeden měl vypnutý gen, druhý měl protein označený genomickým editorem.
„Mutace v tomto genu se vyskytuje také u lidí - pak člověk trpí neplodností. Dokud ale nezjistíme, proč je to nutné, proč modifikuje RNA, nebudeme schopni takovým pacientům pomoci, “vysvětluje vědec.
Ve skutečnosti stále neznáme funkci většiny lidských genů. Zjistit, že je to základní úkol řešený mnoha výzkumnými skupinami po celém světě, včetně Ruska. Myší genom je velmi podobný genomu člověka. Doufáme, že s pomocí CRISPR-Cas, studium genomu jakéhokoli tvora půjde rychleji.
Sergievova skupina společně s N. N. NN Petrova začala hledat mutace vedoucí k některým typům rakoviny. K nejbližším plánům patří projekt na vytvoření geneticky modifikovaných zvířat pro zemědělství ve spolupráci s All-Russian Research Institute of Chov zvířat a Institute of Gene Biology Ruské akademie věd.
„CRISPR-Cas je fantastický nástroj, který vám umožní změnit genom podle vašeho uvážení a být tak trochu Bohem. Úkolem vědy je v konečném důsledku pochopit, jak funguje tak složité stvoření, jako je savec, “říká vědec.
Řešení základních problémů vědy je skvělé, ale co tato technologie dá léku? V dohledné době bohužel ne moc. Je snadné upravit vejce a zvýšit geneticky modifikovanou myš, ale je nemožné opravit geny dospělého zvířete, natož člověka.
Metody úpravy DNA v somatických (tj. Již vytvořených buňkách) jsou stále velmi neúčinné. Aby se do buňky zavedl nějaký gen vypnutý mutací a donutil jej produkovat určitý protein, musíte z těla odstranit některé buňky, upravit v nich DNA a vložit ji zpět do těla. V zásadě existuje naděje, že tímto způsobem bude možné bojovat s chorobami, jako je Duchenneova svalová dystrofie nebo cystická fibróza, pokud je nezbytné obnovit pracovní kapacitu některé části buněk. Pokud jde o náchylnost k rakovině, genomický editor je dosud bezmocný. Pokud se mutantní gen nachází u člověka, nachází se ve všech buňkách těla. Je nereálné je všechny měnit. A každá buňka s mutací je zdrojem nebezpečí.
Ale i když CRISPR / Cas pomůže odpovědět jen na některé základní otázky a umožní léčbu vzácných genetických chorob, bude to pro lidstvo stále velký krok vpřed.
Tatiana Pichugina